Agitación y mezclado en biorreactores

En esta ocasión comprenderemos la importancia de la operación de la agitación y su importancia en el mezclado en los biorreactores. La agitación tiene una incidencia directa en el mezclado sin embargo, a diferencia de los procesos químicos, la agitación durante el crecimiento de organismos es de suma importancia, ya que favorece una adecuada distribución o mezclado de nutrientes y de temperatura. Por otra parte, una excesiva agitación genera condiciones de estrés en los organismos o inclusive llega a causar lisis celular lo que puede influir directamente en una disminución considerable de los rendimientos de productos biológicos como enzimas, proteínas u otros metabolitos de interés biotecnológico.
Es importante que cuando trabajes en la producción de metabolitos en biorreactores, tomes en cuenta a la agitación, ya que esta operación es fundamental en proceso de optimización y de aumento de la producción de biomoléculas. Entenderás la importancia del cálculo del coeficiente de transferencia volumétrico de oxígeno (KLa) en el diseño de biorreactores.

Conforme avances en el tema, verás que es muy interesante ligar los tipos de agitadores con el mezclado y cómo puede llegar a afectar al metabolismo microbiano. Espero que te sea útil la información que a continuación se presenta y que sirva para consolidar tu preparación como futuro ingeniero en biotecnología.

1.1. Agitación en líquidos
La agitación en todo proceso tanto químico como biológico es fundamental, una buena agitación favorece una óptima distribución de reactivos y de temperatura además de favorecer la transferencia de oxígeno. La agitación en líquidos y por lo tanto el mezclado, es dependiente de la temperatura y de la viscosidad que a su vez, influyen directamente en la absorción de oxígeno del aire al líquido. Debe quedar claro que agitación y mezclado no son sinónimos, ya que el primer término se refiere exclusivamente al movimiento del líquido y el segundo, a distribución azarosa de una o más fases que al inicio, estuvieron separadas.
Por ejemplo, en el tratamiento de efluentes contaminados con sustancias no polares (hidrocarburos), los efluentes puedan ser tratados eficientemente aumentando la disponibilidad de los hidrocarburos lo que en biotecnología se conoce como “biodisponibilidad”. La gran mayoría de los microorganismos utilizados en este tipo de procesos son capaces de producir surfactantes que tienen la misma función que los detergentes, solubilizar compuestos no polares. Los surfactantes, también conocidos como biosurfactantes generan micelas con los hidrocarburos haciendo que este tipo de compuestos estén biodisponibles para el microorganismo (Figura 1).

Figura 1. Formación de micelas (amarillo = biosurfactantes, azul = hidrocarburo), (tomado de Díaz et al., 2005.

Si el medio de crecimiento carece de agitación, no habrá oportunidad de generar la emulsión necesaria para disminuir la carga contaminante (Díaz et al., 2005). Los biorreactores que más se utilizan son reactores con agitación mecánica utilizando rodetes de aspas o turbinas ¿por qué este tipo de configuración?, resulta que una agitación fuerte favorece la formación de micelas e impide el rompimiento de la emulsión, por lo tanto, los reactores de mezcla completa son biorreactores ideales por la agitación que soportan. La agitación favorece la dispersión de las sustancias no polares reduciendo su tamaño por el choque entre las gotas del hidrocarburo con las aspas del agitador, si el biorreactor cuenta con deflectores, se mejora el proceso, en otras configuraciones, la degradación de los hidrocarburos se acelera con la inyección de aire cuya función es mejorar el mezclado (Figura 2).
La agitación es fundamental para procesos aerobios ya que aumenta la presencia de oxígeno en el medio, también es necesaria cuando se necesitan condiciones oxidativas por ejemplo, en la producción de enzimas oxidativas. Más adelante veremos otros ejemplos que involucren a la agitación y mezclado como parte fundamental en la producción de metabolitos.

Figura 2. Configuración de un biorreactor para el tratamiento de efluentes con hidrocarburos (tomado de Díaz et al., 2005).

Vamos a seguir y a explicar mejor los beneficios de la agitación y mezclado.

1.1.1. Importancia de la agitación
Cuando iniciamos un proceso de producción de metabolitos nos preguntamos ¿Por qué es importante la agitación? ¿Es necesario tener una mezcla adecuada en nuestro medio de producción?, ¿qué ganamos al agitar un biorreactor?, ¿la agitación y mezclado favorece la producción de metabolitos? Antes de contestar a estos interrogantes tendríamos que definir el objetivo de la agitación y mezclado y así podríamos resolver las dudas planteadas.
Objetivo de la agitación y mezclado.

En la industria química y en la biotecnológica, muchas operaciones dependen fundamentalmente del grado de agitación y mezclado, ya que esto favorece la reacción. Se puede definir la agitación como el forzar a los líquidos o gases a adquirir movimiento a través de una fuerza que generalmente, es mecánica. El mezclado implica que a partir de fases individuales ya sea de líquidos o gases con un sólido o no, se alcance una solución homogénea.
Generalmente la agitación de líquidos se da con más frecuencia en recipientes cilíndricos con ayuda de un sistema mecánico llamado motor. Para romper el flujo laminar o el flujo circulatorio y favorecer el flujo turbulento se utilizan deflectores. La agitación de transmite con ayuda de una flecha o eje provista de palas o de algún sistema de cuya función es agitar el líquido. En la Figura 3 se muestra un esquema muy general de un biorreactor con agitador de rodetes.

Fig. 3. Biorreactor provisto de un sistema de agitación de rodetes, (tomado de García y Jáuregui, 2006).

Podemos decir que la agitación y como consecuencia el mezclado, son operaciones fundamentales en un bioproceso, entre algunos beneficios de la agitación y mezclado podemos decir que:

1. Mejora la disponibilidad de nutrientes en el medio de producción.
2. Mantiene constante la concentración de oxígeno en los reactores.
3. Disminuye el efecto de la concentración de reactivos y productos sobre el metabolismo de microorganismo al evitar zonas de concentración.
4. Mejora la transferencia de calor propiciando una temperatura homogénea en todo el biorreactor.
   Como puedes observar, conocer los beneficios de un buen agitado y mezclado y además los fundamentos de cómo mejorarlo es primordial al momento de diseñar equipos o para mejorar los rendimientos de metabolitos con alto valor agregado. Durante la agitación invariablemente se generan zonas donde la agitación es muy pobre o inclusive llega a ser nula, en un biorreactor carente de deflectores es común la formación de vórtices donde no hay mezclado. En la Figura 4 se muestra un biorreactor a diferentes velocidades de agitación, la zona azul es donde se presentan los problemas de agitación, en la zona amarilla el mezclado es bueno mas no excelente y en la zona verde, el mezclado es perfecto. Como se puede observar, el mezclado es directamente proporcional a la velocidad de agitación, así, a mayor agitación, mejor será el mezclado.

Más adelante veremos cómo es posible eliminar al máximo la formación de vórtices durante la agitación de biorreactores. Ahora vamos a estudiar un caso práctico, en la producción de enzimas es fundamental una excelente distribución de nutrientes en todo el medio de producción ¿por qué?, porque la expresión de las enzimas está sujeta a procesos de inhibición ya sea por sustrato o por producto, imagínate que dentro del medio de producción existieran zonas donde la agitación es pobre o inclusive nula, que aunque parezca curioso, puede ser un problema común, este tipo de situaciones son muy frecuentes en sistemas de producción de metabolitos a escala industrial por lo que es necesario eliminar esta zonas “muertas” con una buena agitación lo que mejorará el mezclado.

En estas zonas sin agitación se puede llegar a acumular sustrato lo que con llevaría a una inhibición por sustrato o a una acumulación de producto que puede llegar a tener efectos de inhibición tanto para la enzima como para la biomasa. Ahora traslada esta situación a la presentada en la Figura 4, es decir, a la formación de vórtices, ¿cómo evitarlos?, ¿qué efectos tendría la formación de vórtices en la productividad de nuestro reactor? Es por lo tanto primordial diseñar adecuadamente nuestra sistema de agitación y de mezclado, lo que incidirá en un aumento en la producción no sólo de enzimas sino de otros metabolitos.

1.1.2. Tipos de agitación
Has visto ya la importancia de la agitación y mezclado, ahora vamos a ver los tipos de mezclado a los que nos podemos enfrentar cuando tenemos un proceso biológico.
Cuando iniciamos un proceso de producción de metabolitos en cultivo líquido nos preguntamos ¿será necesario agitar?, ¿a qué velocidad debo agitar?. Debemos tener claro que lo primero que tenemos que tomar en cuenta es el microorganismo que utilizaremos para el proceso seleccionado, posteriormente debemos empaparnos de su fisiología para determinar las condiciones de crecimiento y sobre todo, si el microorganismo u organismo es aerobio estricto, facultativo, microaerófilo o anaerobio estricto. Una vez que sabes con que microorganismo trabajarás debes definir el tipo de agitación que se utilizará. De manera general podemos decir que hay dos tipos de agitación que influyen en el mezclado, la primera es la agitación mecánica, la cual puede dividirse a la vez en agitación mecánica y en agitación orbital y la segunda es la agitación con aire. De estos dos tipos (que son la base de la agitación) se derivan todos los demás mecanismos de agitación que veremos más adelante.
Es importante dejar claro que para que aseguremos una mezcla homogénea debemos generar turbulencia dentro del medio de producción ya que este fenómeno garantiza una adecuada transferencia de oxígeno y de calor además, se garantiza una distribución perfecta de nutrientes lo que aumenta los rendimientos, ya que todos los sustratos están en la misma concentración en todo el volumen del biorreactor. Hay que tomar en cuenta que quizás la principal variable en un proceso aerobio es la concentración de oxígeno disuelto en el medio. Hay muchos factores que influyen directamente en la solubilidad del oxígeno en agua o en el medio de producción, podemos mencionar como principales a la temperatura, la velocidad de flujo con que se agita el medio y la viscosidad. A altas temperaturas baja la capacidad del agua para absorber oxígeno (Valencia-Quiñones et al., 2011), a velocidades de flujo baja se favorecen flujo laminares lo que disminuye la capacidad de absorción de oxígeno del agua, la viscosidad es otro factor importante, una alta viscosidad disminuye la solubilidad de oxígeno del agua (Soler y Buitrago, 2010).
Por lo tanto, debemos controlar estas variables para mantener siempre una misma concentración de oxígeno disuelto en el medio de producción pero, ¿cómo lo hacemos?, generalmente, la agitación resuelve este problema que va de la mano con la elección de un buen sistema de agitación pero recuerda, una agitación excesiva puede ser dañina para los organismos que estamos cultivando (Bedoya y Hoyos, 2010), por lo tanto, el diseño del reactor y la debida selección del sistema de agitación es fundamental en todo proceso biotecnológico. Haremos a continuación énfasis en un proceso de tratamiento de efluentes de origen textil, la industria textil año tras año desecha enormes cantidades de colorantes en sus aguas de proceso, estas aguas presentan coloraciones que impiden la fotosíntesis si son desechadas sin tratamiento previo.
Existen diversos procesos químicos, físicos y biológicos que pueden ser utilizados para su tratamiento, cada proceso presenta pros y contras, un proceso biológico es muy eficiente aunque un poco tardado, pero el efluente obtenido no presenta riesgos tóxicos tanto para la flora como para la fauna acuática. Los procesos biológicos oxidativos son los más adecuados ya que favorecen la degradación de las moléculas de los colorantes textiles.

Bajo este antecedente podríamos entonces tomar decisiones, ¿qué tipo de agitación sería la más adecuada para tratar un efluente textil mediante métodos biológicos? Si de antemano sabemos que necesitamos favorecer un medio oxidativo en nuestro sistema de tratamiento, entonces la agitación debería cubrir este requisito ¿qué tipo de agitación sería la más adecuada?, ¿agitación mecánica?, ¿agitación con aire? Parece obvia la respuesta sin embargo, al momento de tomar decisiones debemos de contar con más información como la fisiológica y el tipo de molécula a degradar. De antemano sabemos que la agitación con aire favorecería la máxima disolución de oxígeno y por lo tanto debería ser la mejor elección. En los siguientes temas veremos diferentes mecanismos de agitación y mezclado y condiciones de cultivo de tal forma que aseguremos una debida distribución de oxígeno en nuestro medio de producción.

1.2. Equipos de agitación
Ahora que ya tenemos claro lo importante que es la agitación y mezclado en los sistemas biológicos vamos a estudiar los sistemas de agitación con los que contamos para el diseño del biorreactor. No existe el sistema perfecto pero sí podemos optimizar la operación de agitación y por lo tanto mejorar considerablemente el mezclado. La elección del sistema de agitación tiene como finalidad el de tener una mezcla homogénea en el biorreactor a través de la generación de flujos turbulentos que ya hemos visto su importancia.
Hay varios criterios a tomar en cuenta para clasificar los agitadores los principales son por el tipo de flujo a formar, por la viscosidad del fluido, por la relación entre el diámetro de agitador y del tanque del reactor, por la velocidad tangencial que se desea inducir en el fluido, por el tipo de flujo que se desea manejar (laminar o turbulento) y por la geometría del fondo del reactor.
Dependiendo del sistema de agitación se formarán diferentes flujos a través del biorreactor (Figura 5) (García y Jáuregui, 2006). En reactores químicos podemos tener velocidades de agitación muy grandes los que garantiza una mezcla perfecta (Figura 6), este principio no lo podemos aplicar en sistemas biológicos ya que como ya lo hemos visto, causan estrés a los organismos y lisis celular lo que conlleva a pobres rendimientos. A continuación vamos a describir algunos sistemas de agitación que pueden ser utilizados en procesos biotecnológicos.

También es posible predecir el comportamiento del mezclado utilizando software
especializado que te permiten estudiar el comportamiento de biorreactor. El uso de este
tipo de software es imprescindible ya que mejorarás el diseño del equipo. Uno de los más
utilizados es el software Visimix Turbulent 2.0 que simula en función del diseño del
equipo el comportamiento del mezclado (Figura 7).

Figura 7. Imagen del simulador VisimixTurbulent 2.0 que permite predecir las líneas de flujo enun biorreactor, (tomado de García y Jáuregui, 2006).

Para complementar lo anteriormente comentado te invito a que busques videos referentes
a “Agitadores y mezclado de líquidos”.

1.2.1. Rodetes o agitadores
Los rodetes se dividen en dos grandes grupos, los rodetes de flujo axial que generan
flujos paralelos al eje del rodete, y los rodetes de flujo radial, que generan flujos en
dirección radial o tangencial al eje de agitación (Figura 8). Dependiendo de la
configuración los rodetes pueden ser en forma de hélices, palas o turbinas. Al final de
los tipos de agitadores haremos un resumen para calcular adecuadamente las
dimensiones de los rodetes. Como puedes darte cuenta, se les llama rodetes a la parte
del agitador que genera el movimiento del líquido. La longitud del rodete de un agitador de paletas por ejemplo, es del orden de 50 a 80 % del diámetro interior del tanque y la
anchura del rodete es de un sexto a un décimo de su longitud. Por ejemplo, si el
biorreactor tiene un diámetro de 30 cm y una altura de 50 cm ¿cuál debería ser el tamaño
de los rodetes?
Si aplicamos los anteriormente dicho tendríamos que el tamaño de los rodetes serían de
entre 15 y 24 cm de longitud y con un ancho de entre 8 y 10 cm. Esto implica entonces
que los rodetes deben ocupar en la flecha del agitador, una longitud de entre 15 y 24 cm
con un diámetro de entre 8 y 10 cm. Pero ¿cuántos rodetes?, es importante dejar claro
que para evitar flujo circulatorio de preferencia toda la longitud calculada debe estar
ocupada por lo rodetes o por un solo rodete con las dimensiones estimadas. Ahora bien,
¿qué tipo de rodete es el más adecuado? Vamos a ver a continuación diferentes
configuraciones de rodetes.

Figura 8. Diferentes tipos de flujos en función del tipo de rodete. A = rodete de hélice, flujo axial, B = rodete de pala, flujo radial.

1.2.2. Palas
Las palas o paletas son utilizadas en agitadores que giran de entre 50 y 150 rpm (revoluciones por minuto). Para problemas sencillos, un agitador eficaz está formado por una paleta plana, que gira sobre un eje vertical. Las corrientes se forman por la presencia de dos o 3 paletas (Figura 9). Las paletas giran a velocidades bajas o moderadas en el centro del tanque, impulsando al líquido radial y tangencialmente, sin que exista movimiento vertical respecto del agitador, a menos que las paletas estén inclinadas. Las corrientes de líquido que se originan se dirigen hacia la pared del tanque y después siguen hacia arriba o hacia abajo.
Las paletas también pueden adaptarse a la forma del fondo del tanque, de tal manera que en su movimiento rascan la superficie o pasan sobre ella con una holgura muy pequeña. Los agitadores con esta configuración son conocidos como agitadores de ancla. Estos agitadores son utilizados cuando se desea evitar sólidos depositados sobre superficies donde se transmite calor, como es el caso de reactores enchaquetados o con camisa pero no se consideran como buenos agitadores. Para mejorar el proceso de agitación, este tipo de mecanismos se acoplan con agitadores de pala de otro tipo, los cuales se mueven a una velocidad elevada y giran normalmente en sentido opuesto. El criterio de diseño es el anteriormente descrito. Se debe tener cuidado con la clasificación de los agitadores de palas ya que a los dispersadores se les considera agitadores de palas. Un dispersador en un agitador de alta velocidad pero genera una mezcla imperfecta debido a la alta velocidad con que gira que favorece la formación de flujos circulatorios. En la figura 10 se presenta un agitador de palas (de flujo axial) y un dispersador.

En la siguiente tabla se resumen las características principales de los rodetes de palas

1.2.3. Hélices
Los agitadores con hélice (Figura 11) generan flujos axiales, generalmente este tipo de agitadores son utilizados cuando se necesitan altas velocidades de agitación y se emplean para líquidos con baja viscosidad. El tamaño de los agitadores es fundamental, para velocidades de agitación altas (1.150 o 1.750 rpm) se utilizan agitadores pequeños; para agitaciones menores es decir de alrededor de 400 a 800 rpm se utilizan agitadores de mayor tamaño. Estos dos criterios son importantes ya que las células generalmente sufren de estrés por arriba de las 500 rpm. Las corrientes de flujo que se generan al utilizar agitadores de hélice inician desde el agitador moviéndose a través del líquido hasta que son desviadas por el fondo o las paredes del tanque. Este movimiento puede mejorarse si el biorreactor cuenta con bafles mejorando el mezclado en todo el medio de producción.
La columna de líquido que se forma genera remolinos de elevada turbulencia, que inician en el agitador arrastrando en su movimiento a todo el líquido estancado en el cilindro. Este tipo de agitación presenta un mayor mezclado que el que se obtendría mediante una columna equivalente, ya sea por inyección de aire o por movimiento mecánico creado por una boquilla estacionaria. Los rodetes de la hélices decir, las palas, cortan o friccionan vigorosamente el líquido. Debido a que las corrientes de líquido son persistentes, los agitadores de hélice son muy eficientes para biorreactores de gran tamaño. Para biorreactores muy grandes, es decir, del orden de 1500 m3 se pueden utilizar agitadores múltiples que mejoran el mezclado.
El diámetro de los agitadores de hélice para biorreactores es muy variable pero raramente es mayor de 45 cm, independientemente del tamaño del biorreactor ya que a mayor tamaño de las hélices las fuerzas de fricción pueden causar lisis celular. En tanques de gran altura, pueden disponerse dos o más hélices sobre el mismo eje, moviendo el líquido generalmente en la misma dirección pero también es posible tener configuraciones con flujos que se entrecrucen cambiando solo la posición de las paletas. En la figura 12 se presentan dos configuraciones de hélices. Se puede concluir por lo tanto que el diseño de la hélice dependerá de la calidad de la mezcla que se desea y del tamaño del biorreactor.

En la tabla 2 se resumen las principales características a tomar en cuenta en el diseño de agitadores de hélice:

1.2.4. Turbinas
La mayoría de los agitadores de turbina son muy parecidos a tener agitadores múltiples,
las paletas giran a velocidades muy elevadas sobre un eje que va montado centralmente
dentro del tanque. Las líneas de flujo que se forman dependen de la forma de la paleta
que puede ser recta, curva, inclinada o vertical. El rodete puede ser abierto, semi-cerrado
o cerrado. El diámetro de los rodetes generalmente es menor que en el caso de
agitadores de paletas en un orden del 30 al 50% del diámetro del tanque aproximadamente. Los agitadores de turbina son los más utilizados cuando tenemos la certeza de que la viscosidad del medio cambiará a lo largo del tiempo. También es posible utilizarlos en medios de producción donde la viscosidad es baja. Este tipo de agitadores producen corrientes muy intensas que se extienden por todo el medio de producción generando un excelente mezclado, sin embargo, su uso en procesos de producción de metabolitos es poco común, ya que en las proximidades del rodete existe una zona de corrientes rápidas, de alta turbulencia e intensos esfuerzos cortantes que en definitiva, causan lisis celular. Las corrientes principales son tanto radiales como tangenciales, las corrientes tangenciales dan lugar a vórtices y torbellinos, que se deben evitar por medio de placas deflectoras con el fin de que el rodete sea más eficaz.
Un ejemplo es el agitador de turbina semiabierto que se conoce también como agitador de disco con aletas, este tipo de agitadores se emplea para dispersar o disolver gases en líquidos, bajo este concepto, el uso de este tipo de agitadores podría mejorar la difusión de oxígeno que es un gas, en el medio de producción de algún metabolito. En este tipo de agitadores, el gas entra por la parte inferior del eje del rodete; las aletas lanzan las burbujas grandes y las rompen en muchas pequeñas, con lo cual se aumenta grandemente el área interfacial entre el gas y el líquido. La configuración de este tipo de agitadores se puede mejorar si la inyección del gas se realiza desde el fondo del biorreactor. En la figura 13 se muestra la imagen de una turbina de agitación.

En la tabla 3 se resumen las características de los agitadores de turbinas:

1.2.5. Deflectores
Los deflectores son aditamentos que se colocan dentro de un biorreactor para mejorar la
mezcla. Son fabricados de un material inerte (generalmente de acero inoxidable) y su
utilización mejora la productividad de un proceso biotecnológico. Los deflectores pueden ir pegados al tanque de reacción a todo lo largo o mediante pies que los sostengan. La
posición de los deflectores tiene influencia directa en el rompimiento del flujo circulatorio
(Figura 14).

El objetivo para usar deflectores en biorreactores es para evitar el flujo circulatorio. El flujo
circulatorio representa un grave problema en procesos biológicos ya que evita una
adecuada dispersión de nutrientes y sobre todo, disminuye la absorción de oxígeno. En
un flujo circulatorio se generan flujos preferenciales donde hay una mezcla perfecta y
hay zonas dentro del biorreactor donde no llega la agitación y la disponibilidad de
nutrientes y de oxígeno son muy pobres. En la figura 15 se presentan algunas
configuraciones típicas de biorreactores que presentan flujo circulatorio.